产品货号：
BTN100102
中文名称：
His标签蛋白纯化试剂盒
英文名称：
His-Tagged Protein Purification kit
产品规格：
20T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是基于组氨酸-镍(His-Ni)亲和层析法开发的His标签融合重组蛋白纯化试剂盒。
保存：室温，其中镍柱介质长期需4℃保存，溶菌酶+核酸酶和PMSF溶液需-20℃保存，有效期一年。
去离子水、20%乙醇、针头过滤器（0.45μm）
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- 一站式套装，含所需的镍柱介质、上柱液、洗柱溶液和层析柱，用户只需要提供表达His蛋白的细菌（酵母、杆状病毒、培养细胞）即可，非常方便。
- 一次过柱即可获得纯度高达95%的His-标记蛋白。
- 可在变性和非变性条件使用。
- 每次可以处理20mL的表达菌液，适合初步筛选和鉴定。
- 提供4mL浓度为50%的Ni-Agarose介质，其最大载量为20～30mg His标记蛋白质/mL介质。本介质可以反复使用。
| 组分 | 规格 |
| 镍柱介质(50%) | 4mL |
| 1M咪唑溶液 | 25mL |
| 1M Tris-HCl溶液，pH7.9 | 25mL |
| 5M NaCl溶液 | 25mL |
| 溶菌酶+核酸酶(3∶1∶1) | 50mg |
| 盐酸胍干粉 | 6g |
| 尿素干粉 | 20g |
| PMSF溶液(10mg/mL) | 0.5mL |
| 亲和层析柱(6mL) | 1套 |
保存：室温，其中镍柱介质长期需4℃保存，溶菌酶+核酸酶和PMSF溶液需-20℃保存，有效期一年。
去离子水、20%乙醇、针头过滤器（0.45μm）
- 整个实验需避免含巯基乙醇、DTT和EDTA等成分。
- 若洗脱液不能将His标记蛋白洗脱下来，可改用pH6.5～4.5的pH递减的Tris-HCl洗脱。
- 将镍柱介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中（镍柱介质用量需要根据His蛋白产量决定，其最大载量为20～30mg His标记蛋白质/mL介质，请根据实验需要取适量的镍柱介质加入层析柱）。
- 用5倍柱体积（指镍柱介质的体积，下同）自备去离子水洗柱，共三次。
- 用5倍柱体积的新配结合液洗柱（配方如下，以10mL为例），共三次。
成分 用量 在结合缓冲液中的浓度 1M Tri-HCl（pH7.9） 0.2mL 20mM 1M咪唑溶液 0.1mL 10mM 5M NaCl溶液 1mL 500mM 自备去离子水 8.7mL - - 室温5000g离心10分钟收集20mL表达菌液，弃上清，沉淀（约100mg）放冰上待用或放-80℃保存。最好用不加诱导物的菌液做对照样。
- 如果超声破碎细菌：加入1mL冰浴的结合液（1mL菌液需要用50μL结合液），再加入25μL PMSF（10mg/mL）溶液，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。
如果酶法裂解细菌：加入1mL冰浴的含溶菌酶的结合液（先取20mL结合液，加入所有50mg溶菌酶-核酸酶干粉，溶解后分装成1mL/管，剩余的-20℃放置），再加入25μL PMSF（10mg/mL）溶液，冰上放置30分钟。 - 4℃下13000～15000g离心10分钟，去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱，收集上清，留样做SDS-PAGE电泳对照。如果要纯化裂解液中可溶部分的His标记蛋白，则直接进入第7步；如果要纯化裂解液中包涵体（沉淀部分）中的His标记蛋白，则直接进入第12步。
- 纯化细胞裂解液中可溶部分的His标记蛋白
- 将上步得到的上清液上柱，让重力使裂解液自然流出。如要提高His标记蛋白与介质的结合效率，可用试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上，让细菌裂解液和介质在4℃结合30分钟或过夜。
- 用10倍柱体积结合液洗柱（配方见上表），收集并保存穿透液（含杂质或没被吸附的His标记蛋白，可做SDS-PAGE电泳的对照）。
- 如果用一步式洗脱法（适合已经找到最佳咪唑浓度的情况），则直接用适量的新鲜配制的洗脱液洗柱，收集并保存穿透液（含His标记蛋白）。洗脱液的配方如下（以1mL体积和最佳咪唑浓度是500mM为例）：
成分 用量 在洗脱液中的浓度 1M Tri-HCl （pH7.9） 20μL 20mM 1M咪唑溶液 500μL 500mM 5M NaCl溶液 100μL 500mM 自备去离子水 380μL - - 如果用多步式洗脱（适合不知道最佳咪唑浓度或一步式洗脱杂质多的情况），则按上表配制一系列咪唑浓度不同（如40、60、100、200、300和500mM），其他成分浓度不变的洗液，按从低到高的顺序洗涤并收集样品，SDS-PAGE电泳检测His标记蛋白所在的区域。
- 洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），最后堵住层析柱下端的漏口，4℃保存待下次使用。
- 将上步得到的上清液上柱，让重力使裂解液自然流出。如要提高His标记蛋白与介质的结合效率，可用试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上，让细菌裂解液和介质在4℃结合30分钟或过夜。
- 纯化包涵体中His标记蛋白
- 将第6步离心得到的包涵体沉淀重悬于1～3mL含盐酸胍结合液中或1～3mL含尿素结合液中（建议优先使用尿素做变性剂，因为得到的洗脱液可以直接跑SDS-PAGE，而用盐酸胍的洗脱液需先除盐后才能电泳）。冰浴1小时以使包涵体溶解，期间可轻柔摇晃几次。含变性剂的结合液配方如下（以10mL为例）：
成分 含盐酸胍结合液 含尿素结合液 1M Tri-HCl（pH7.9） 200μL 200μL 5M NaCl溶液 1mL 1mL 盐酸胍（MW=95.6） 5.7g 无 尿素（MW=60.1） 无 4.8g 自备去离子水 至10mL 至10mL - 室温10000×g离心20分钟，沉淀为未溶解的包涵体。将上清（含溶解后的His标记蛋白）以自备的针头过滤器（0.45μm）过滤。
- 将滤过液上柱，后续纯化步骤同第7-第11步。只是所用结合液和洗脱液均含变性剂，含变性剂的洗脱液配方见下表（以1mL为例）：
成分 含盐酸胍洗脱液 含尿素洗脱液 1M Tri-HCl（pH7.9） 20μL 20μL 1M咪唑溶液 500μL 500μL 5M NaCl溶液 100μL 100μL 盐酸胍（MW=95.6） 0.57g 无 尿素（MW=60.1） 无 0.48g 自备去离子水 至1mL 至1mL
- 将第6步离心得到的包涵体沉淀重悬于1～3mL含盐酸胍结合液中或1～3mL含尿素结合液中（建议优先使用尿素做变性剂，因为得到的洗脱液可以直接跑SDS-PAGE，而用盐酸胍的洗脱液需先除盐后才能电泳）。冰浴1小时以使包涵体溶解，期间可轻柔摇晃几次。含变性剂的结合液配方如下（以10mL为例）：
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